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  • 北苍术饲料添加剂发酵工艺的研究
    添加时间:14-08-06 09:26:36作者:来源:点击数:
     
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                                         刁新平,叶应建,王利军,陈美霞
                      ( 东北农业大学动物科技学院,哈尔滨 150030 )
        摘要:研究北苍术饲料添加剂最佳发酵工艺。在单因素试验基础上,采用3个因素(含水量、接菌量、发酵时间) 3 个水平的L9(33)正交试验优选发酵工艺条件,并采用蒽酮-浓硫酸法测定发酵后北苍术多糖含量。结果表明,最佳发酵工艺为:含水量在50%,接菌量为4%,发酵时间为3 d。实验表明,此发酵工艺操作简单,能显著提高多糖含量,可为北苍术饲料添加剂开发利用提供新方法。
        关键词:北苍术;饲料添加剂;多糖;发酵工艺
        中图分类号:S767.5;X172 文献标志码:A 文章编号:1005-9369(2013)12-0104-04
        北苍术为菊科植物北苍术的干燥根茎,分布于东北、华北以及山东、湖南、陕西等省,生长于低山阴坡灌木丛中及山坡草地。性味辛、苦、温,能健脾、燥湿、解郁、辟秽,主治湿盛困脾、脘腹胀满、呕吐、泻泄、痢疾、疟疾、痰饮、水肿、风寒感冒等症[1],在畜牧上常用作中草药饲料添加剂。而发酵作为中草药的一种炮制方法,能提高中草药药效,降低毒副作用,产生新的药效物质[2-4]。多糖是北苍术药效的主要成分,本文以发酵前后北苍术中多糖的含量为指标,对北苍术饲料添加剂发酵工艺进行研究,以确定最佳发酵工艺。
        1 ·材料与方法
        1.1 材料
        中药:北苍术,购自哈尔滨药材市场,65 ℃烘干,粉碎后过40目筛,备用。
        仪器:超净工作台,DL-CJ-ZND(购自北京东联哈尔仪器制造有限公司);紫外分光光度计,UV-2401PC(购自日本岛津公司);二氧化碳培养箱,BPN-80CW(购自上海一恒科学仪器有限公司);高压灭菌锅,MLS-3780(购自日本三洋公司);可调温水浴锅,DK-S12(购自上海森信实验仪器有限公司);热空气消毒箱,GR140(购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂); 电子天平,AR1140(购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);台式高速冷冻离心机,Allegra 64R(购自美国Beckman Coulter 公司);真空包装机,DZ-400/2L(购自南通彩星工贸有限公司);超声波提取机,KQ-500DB(购自昆山市超声仪器有限公司)。
        试剂:MRS肉汤培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司);乙醇,葡萄糖,蒽酮,浓硫酸,浓盐酸及其他试剂均为分析纯(购自哈尔滨化学试剂公司)。
        1.2 方法
        1.2.1 标准曲线的绘制
        精密称定105 ℃干燥至恒重葡萄糖标品10 mg,蒸馏水定容至100 mL,摇匀,即得0.1 mg · mL-1葡萄糖对照品溶液。精密吸取该溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 、1.0 mL,置于10 mL干燥具塞试管中,以蒸馏水补足至1.0 mL,分别精密加入蒽酮-硫酸溶液(取0.1 g蒽酮,溶于100 mL 80% 的浓硫酸中)4.0 mL,混匀,后沸水浴10 min。以未加供试品的溶液为参比,在625 nm 处测定吸光度值。
        通过对数据进行线性回归,得到回归方程Y=44.55x+0.026,R2=0.997。
        1.2.2 样品溶液的制备与测定
        精密称取苍术样品0.5 g 于50 mL 离心管中,加入30 mL乙醇,静置30 min,超声提取30 min,于3 000 r · min-1离心机中离心15 min,弃上清液,重复上述操作1次,蒸干滤渣,后加入2% HCl 30mL,沸水浴提取1 h,离心取上清液于100 mL容量瓶中,重复操作1次,合并滤液,后用2% HCl定容至刻度。混匀,取1 mL 于25 mL 容量瓶中,用2% HCl 定容至刻度。取制备的溶液1 mL于10mL干燥的试管中,加入4 mL 蒽酮硫酸溶液,混匀,水浴加热10 min,在625 nm 中测量其吸光度。经测得未发酵苍术多糖含量为5.58%。
        1.2.3 菌液的制备
        在无菌条件下,将购回的嗜酸乳杆菌菌粉按说明书比例,用事先灭菌的蒸馏水充分溶解,静置,吸取1 mL菌溶液到装有99 mL MRS培养基于250 mL三角瓶中,加盖密封,置于电热恒温振荡培养箱中于37 ℃下培养24 h。复壮两代后,通过平板计数法进行细菌计数,比较该菌正常活菌数(30亿·g-1),来决定复壮次数。将取活化后的的菌种用接种环转接到装有100mL MRS液体培养基于250 mL三角瓶中,密封,置于电热恒温振荡培养箱中于37 ℃下培养24 h后,备用。
        1.2.4 数据统计分析
        采用SPSS 17.0 统计软件对正交试验数据进行统计分析。
        2· 结果与分析
        2.1 发酵试验碳源、氮源的选择
        由于嗜酸乳杆菌发酵过程中,培养基中碳源和碳源的含量对其影响较大,因此,需要对碳源和氮源对本试验的影响进行验证。
        精密称取烘干后北苍术20 g若干份,添加不同量的碳源(葡萄糖)和氮源(蛋白胨),添加量如图1所示。在北苍术含水量50%,接菌量为6%情况下,发酵1 d,烘干测发酵后北苍术多糖的含量。由图1结果表明,添加不同比例碳源和氮源,发酵后多糖含量增加很少,可说明北苍术中所含碳源和氮源的量能满足嗜酸乳杆菌生长需要,发酵试验中不需要额外添加碳源和氮源。
        
        2.2 含水量对发酵后北苍术多糖含量的影响
        精密称取烘干后的北苍术20 g,平行3份,装入发酵袋中,接入嗜酸乳杆菌6%,分别加入不同体积灭菌后的蒸馏水,使含水量达到20%、30%、40%、50%、60%,抽真空,在37 ℃的二氧化碳培养箱中发酵2 d。后烘干取0.5 g,测发酵后多糖的含量。结果如图2,结果表明,含水量小于50%时,随着含水量的增加,发酵后苍术多糖含量增加,当含水量达50% 时,苍术多糖含量最高,当含水量大于50% 时,发酵后苍术多糖含量下降,所以选择含水量50% 进行其他筛选。
        
        2.3 接菌量对发酵后北苍术多糖含量的影响
        精密称取烘干后北苍术20 g,平行3份,装入发酵袋中,分别接入不同体积的菌液,使接菌量达到2%、4%、6%、8%、10%,后加入灭菌后的蒸馏水,使含水量达到50%,抽真空,在37 ℃二氧化碳培养箱中发酵2 d。后烘干取0.5 g,测发酵后多糖含量。结果如图3,结果表明,在接菌量小于8% 时随接菌量增加,苍术发酵后多糖含量逐渐升高,当接菌量高于8% 时,苍术发酵后多糖含量降低,因此选择接菌量8% 进行其他单因素筛选。
        
        2.4 发酵时间对发酵后北苍术多糖含量的影响
        精密称取烘干后北苍术20 g,平行15份,均分5组,装入发酵袋中,使接菌量为8%,含水量为50%,抽真空,在37 ℃二氧化碳培养箱中发酵时间为1、2、3、4和5 d。烘干后取0.5 g,测发酵后多糖含量。结果如图4,结果表明,随发酵时间增加,发酵后苍术多糖含量先增加后降低再增加,之后趋于平稳,且发酵时间在2和4 d时,苍术发酵后多糖含量较高,但考虑到生产效率和经济效益方面,因此选择发酵时间为2 d为最佳。
        
        2.5 正交设计优选条件
        2.5.1 因素和水平的确定
        根据单因素试验结果,选取含水量(A)、接菌量(B)和发酵时间(C)3 个因素,每个因素3 个水平,见表1。
        
        2.5.2 正交试验结果及方差分析
        精密称取北苍术20 g,分别按正交设计表设定的条件进行发酵试验,操作同2.2 项,以发酵后苍术多糖含量为指标,结果见表2。方差分析结果见表3。
        
        
        由表2、表3可知,3个因素对发酵后苍术多糖含量影响的主次顺序为:B(接菌量)>A(含水量)>C(发酵时间),可知发酵工艺条件最佳组合为A2B1C2。方差分析结果表明接菌量对发酵试验结果影响具有显著性(P<0.05),A、C 因素的影响均无显著性(P>0.05)。即发酵北苍术的最佳工艺组合为含水量50%,接菌量为4%,发酵时间为3 d,此条件下发酵后苍术多糖含量为9.55%,与未发酵苍术相比,多糖含量增加71.1%。
        3 ·讨论与结论
        在发酵试验中,北苍术含水量是嗜酸乳杆菌正常生长活动重要因素。张苗蕾等研究发现,在适宜含水量下,发酵时产气最高,含水量过高或过低都会使产气降低[5],都会影响发酵品质。接菌量对发酵效果有显著影响,吴晖等研究发现,随着接菌量增加,蛋白酶活力呈现出先上升后下降趋势[6],本研究接菌量对发酵后多糖含量变化的影响与之吻合。微生物发酵最佳时期是对数期和稳定期,进入衰亡期时,发酵的效果会随之下降,发酵时间选择即基于此。叶劲松研究发现,发酵时间过短或过长都对产品品质不利,过短发酵不能充分进行,过长则容易产生酸味过大、颜色过深等现象[7]。本试验对发酵时间的研究结果与之一致。本试验中设计三因素三水平正交试验,与上述单因素试验作比较,正交试验结果与单因素试验结果不一致。
        微生物发酵中草药是在继承中药炮制学发酵法的基础上,结合现代生物工程的发酵技术而形成的高新技术。不但能使中草药中有效物质最大限度地释放,增强其原有性能,而且把发酵后中草药添加到动物饲料中,能显著促进动物生长,提高免疫力。朱新术研究用乳酸菌发酵黄芪,结果发现发酵液中粗多糖的得率可达13.03%,比未发酵黄芪原粉提高131%[8]。把用微生物发酵后的黄芪作为仔猪饲料添加剂,能增加仔猪采食量、提高仔猪日增重、提高饲料利用率、降低仔猪腹泻率及提高仔猪免疫力[9]。苍术作为一种中草药饲料添加剂,也常用到动物生产中,李启照在蛋鸡全价饲料中添加苍术多糖,对蛋鸡的传染性支气管炎有预防作用,可使蛋鸡发病率、死亡率降低,还可使产蛋率提高,蛋重增加,饲料消耗降低,饲料转化率提高,经济效益明显提高[10]。北苍术最佳发酵工艺为含水量为50%,接菌量为4%,发酵时间为3 d。本文通过发酵手段,能使北苍术多糖最大量释放,但发酵后北苍术很少用到畜禽养殖上,因此本试验可为畜禽生产实践提供参考。
    [参考文献]
    [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京: 化学工业出版社, 2010.
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    [3] 戴万生, 赵荣华. 发酵法对大黄蒽醌类成分含量的影响[J]. 云南中医中药杂志, 2005, 26(1): 38-39.
    [4] 李国红, 沈月毛, 王启方, 等. 发酵三七中的皂怍成分研究[J].中草药, 2005, 36(4): 499-500.
    [5] 张苗蕾, 张从良, 李顺, 等. 含水量对牛粪和玉米秸秆干式厌氧发酵的影响[J]. 江苏农业科学, 2009(6): 401-403.
    [6] 吴晖, 卓林霞. 发酵条件对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中的蛋白酶活力的影响[J]. 现代食品科技, 2008, 24(10): 973-976.
    [7] 叶劲松, 李洪军. 发酵时间对发酵猪耳西式火腿品质的影响[J]. 四川食品与发酵, 2006, 42(1): 48-51.
    [8] 朱新术. 发酵黄芪的乳酸菌选育与发酵参数优化研究[D]. 兰州: 中国农业科学院, 2008.
    [9] 韩宇, 刁新平, 李沛军, 等. 发酵黄芪对断奶仔猪日增重、腹泻率及免疫能力的影响[J]. 东北农业大学学报, 2012, 43(12): 6-9.
    [10] 李启照. 苍术多糖对蛋鸡传染性支气管炎的预防作用[J]. 江苏农业科学, 2013, 41(1): 219 -220.

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